Protéomique par Bottom-up

Une approche protéomique de type bottom-up consiste à analyser les peptides protéolytiques issues de protéines purifiées ou en mélange complexe par spectrométrie de masse. Cette approche est la plus utilisée en protéomique pour identifier les protéines mais aussi pour les quantifier ou bien encore pour caractériser leurs modifications post-traductionnelles (phosphorylation, méthylation, acétylation...).

Les protéines sont digérées par une enzyme, le plus souvent la trypsine, afin d'obtenir un mélange de peptides. Ces derniers sont séparés par un système de nano-chromatographie liquide (nanoLC) et un module de mobilité ionique avant d'être analysés en ligne par un spectromètre de masse à haute résolution en tandem (nanoLC-MS/MS). Classiquement, nous utilisons des méthodes de type DDA (Data Dependant Acquisition). L'objectif est de mesurer la masse des peptides puis de les sélectionner séquentiellement pour les fragmenter afin d'obtenir des informations de structure (séquence, localisation et nature des modifications). Ces données sont alors confrontées à des banques de données (ex UniprotKB, NCBInr) afin d'identifier les protéines et caractériser leurs modifications post-traductionnelles. Des méthodes de type DIA (Data Independant acquisition) peuvent être aussi appliquées sur des modèles d'intérêt. Dans ce cas particulier, plusieurs précurseurs sont fragmentés ensemble et l'interprétation des données s'effectue à l'échelle des spectres de fragmentation à l'aide d'outils dédiés.

Quand les protéines sont digérées in-solution et analysées par nanoLC-MS/MS, on parle alors de stratégie de type shotgun. Cette stratégie est généralement privilégiée. Cependant, on peut également digérer les protéines in-gel (SDS-PAGE 1D ou 2D) et analyser les extraits peptidiques par nanoLC-MS/MS, on parle de stratégie de type GeLC-MS/MS. Cette stratégie présente l'avantage de diminuer la complexité des échantillons protéiques.

PIXANIM vous propose de la protéomique bottom-up pour des approches de type:

Globales :

• Deep proteome : Carte de référence, inventaire le plus exhaustif possible d'un protéome ou d'un sous-protéome donné (fractionnement sub-cellulaire) à partir d'extraits protéiques/peptidiques : Identification des protéines issues de mélanges complexes par nanochromatographie liquide monodimensionnelle couplée à de la mobilité ionique et à un spectromètre de masse à haute résolution en tandem (LC-1D-MS/MS, colonnes RP).
• Recherche de biomarqueurs spécifiques par des analyses différentielles et quantitatives (états physiologiques différents, sain vs pathologique, effets pharmacologiques...). Les analyses différentielles sont réalisées essentiellement sans marquage (Label free) par le biais de méthodes quantitatives de type XIC (Extracted Ion Chromatogram)
• µproteomic et single cell proteomic (SCP) : l'objectif est d'appliquer la protéomique à des modèles biologiques rares et précieux dont les quantités en matériel sont limitantes (≤ qq pg ou ng de peptides/ injection) pour un phénotypage cellulaire fin, à l’échelle individuelle, afin de limiter les variabilités (inter-individus) et de gagner en puissance statistique lors d’analyses comparatives.

Ciblées :

• Etude du polymorphisme des protéines avec la caractérisation et localisation de modifications post-traductionnelles (phosphorylation, méthylation, acétylation, acide pyroglutamique, site de glycosylation, prénylation...). Dans ce contexte, nous pouvons procéder à un enrichissement de peptides portant notamment une modification post-traductionnelle (ex : HILIC, IMAC, TiO2 pour phosphopeptides), utiliser des méthodes de MS/MS plus adaptées (Neutral Loss- MS3,MSA (Multistage activiation) ou bien encore utiliser différents modes de fragmentation (CID, HCD), caractérisation des sites N-glycosylés après déglycosylation par PNGase.
• Contrôle de la pureté d'un échantillon (protéines recombinantes, peptides de synthèse, suivi de purification...)

Les analyses par spectrométrie de masse sont accompagnées de l’exploitation et interprétation des résultats, de conseils et d’aide à la publication.