Protéomique par Bottom-up

Une approche protéomique de type bottom-up consiste à analyser les peptides protéolytiques issues de protéines purifiées ou en mélange complexe par spectrométrie de masse. Cette approche est la plus utilisée en protéomique pour identifier les protéines mais aussi pour les quantifier ou bien encore pour caractériser leurs modifications post-traductionnelles (phosphorylation, méthylation, acétylation...).

Les protéines sont digérées par une enzyme, le plus souvent la trypsine, afin d'obtenir un mélange de peptides. Ces derniers sont séparés par un système de nano-chromatographie liquide puis analysés en ligne par un spectromètre de masse en tandem (nanoLC-MS/MS). L'objectif est de mesurer la masse des peptides puis de les sélectionner séquentiellement pour les fragmenter afin d'obtenir des informations de structure (séquence, localisation et nature des modifications). Ces données sont alors confrontées à des banques de données (ex UniprotKB, NCBInr) afin d'identifier les protéines et caractériser leurs modifications post-traductionnelles.

Quand les protéines sont digérées in-solution et analysées par nanoLC-MS/MS, on parle alors de stratégie de type shotgun.

Quand les protéines sont digérées in-gel (SDS-PAGE 1D ou 2D) et analysées par nanoLC-MS/MS, on parle de stratégie de type GeLC-MS/MS. Cette stratégie présente de nombreux avantages tant sur la préparation de l'échantillon peptidique (extrait peptidique dépourvu de tous les réactifs de réduction/alkylation et peptides de taille adaptée à la MS/MS) que sur la complexité de l'analyse (diminution de l'hétérogénéité par le biais d'une séparation préalable en gel SDS-PAGE 1D ou 2D).

PIXANIM vous propose de la protéomique bottom-up pour des approches:

Globales :

• Cartes de références (inventaire) d'un protéome ou sous-protéome donné à partir d'extraits protéiques/peptidiques : Identification des protéines issues de mélanges semi-complexes par nanochromatographie liquide monodimensionnelle couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-1D-MS/MS, colonnes RP).
• Identification par séquençage de novo (séquences peptidiques partielles ou totales par MS/MS) de peptides endogènes
• Recherche de biomarqueurs spécifiques par des analyses différentielles et quantitatives (états physiologiques différents, sain vs pathologique, effets pharmacologiques...). Les analyses différentielles peuvent se faire avec marquage iTRAQ ou sans marquage de type Label free par le biais de 2 méthodes quantitatives complémentaires : par "spectral counting" et par XIC (Extracted Ion Chromatogram)

Ciblées :

• Etude du polymorphisme des protéines avec la caractérisation et localisation de modifications post-traductionnelles (phosphorylation, méthylation, acétylation, acide pyroglutamique, site de glycosylation, prénylation...). Dans ce contexte, nous pouvons procéder à un enrichissement de peptides portant notamment une modification post-traductionnelle (ex : HILIC, IMAC, TiO2 pour phosphopeptides), utiliser des méthodes de MS/MS plus adaptées (Neutral Loss- MS3,MSA (Multistage activiation) ou bien encore utiliser différents modes de fragmentation (CID, HCD), caractérisation des sites N-glycosylés après déglycosylation par PNGase.
• Contrôle de la pureté d'un échantillon (protéines recombinantes, peptides de synthèse, suivi de purification...)

Les analyses par spectrométrie de masse sont accompagnées de l’exploitation et interprétation des résultats, de conseils et d’aide à la publication.